1.0目標

制定程序就是為生物指標的鑒定提供指導。

2.0范圍

此程序適用于生物指示劑的鑒定，即硬脂酸地芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）ATCC 7953和萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）（枯草芽孢桿菌）ATCC 9372，用于高壓滅菌和隧道驗證。

3.0責任

微生物學家

4.0問責制

質量檢查和質量控制主管

5.0程序

5.1生物指示劑培養物鑒定試驗

5.1.1顯微鏡檢查–將一塊生物指示劑或安瓿懸于  10 ml無菌生理鹽水中。輕輕搖晃懸浮液并將一圈懸浮液轉移到載玻片上。進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察載玻片。亞末端溶脹的細胞中具有橢圓形內生孢子的革蘭氏陽性棒表明嗜熱脂肪地芽孢桿菌的身份。萎縮芽孢桿菌為革蘭氏陽性，呈橢圓形和中心內生孢子狀，細胞未腫脹。

5.1.2增長特征

5.1.2.1將一塊生物指示劑（一個安瓿瓶）懸浮在10 ml營養肉湯中，并在37ºC下孵育48小時。從試管中在每兩個含大豆酪蛋白消化瓊脂培養基的培養皿中劃線一圈。在30ºC至35ºC的溫度下培養一個Petridish，在55ºC至60ºC的溫度下培養24小時。
5.1.2.2如果在55ºC至60ºC的溫度下培養的板顯示出微生物生長的跡象，而在30ºC至35ºC的溫度下培養的板未顯示出微生物生長的跡象，則表明嗜熱性地芽孢桿菌的身份。
5.1.2.3如果在30ºC至35ºC的溫度下培養的平板顯示出微生物生長的跡象，而在55ºC至60ºC的溫度下培養的平板沒有任何微生物生長的跡象，則表明存在萎縮芽孢桿菌。

5.2生物指標中總活菌計數

5.2.1從原始的單個容器中隨機選擇四根生物指示劑的孢子條。
5.2.2將每個孢子條放入帶有三個6 mm玻璃珠和5.0 ml 無菌純凈水的無菌，帶螺帽的平底管中。
5.2.3渦旋4到7分鐘，直到紙架浸入紙漿。
5.2.4加入5.0毫升無菌純凈水。再次渦旋。
5.2.5將1 ml懸浮液轉移到裝有9 ml無菌純凈水和渦旋的試管中。
5.2.6將稀釋管在95ºC–100ºC的預熱浴中放置15±1分鐘，以用于嗜熱地熱芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌80ºC至85ºC。
5.2.7拆下試管，并在冰浴（0ºC–4ºC）中迅速冷卻。
5.2.8將每個熱沖擊管渦旋至少十秒鐘。現在，連續稀釋這些試管以產生30到300個菌落。將每個稀釋管渦旋至少十秒鐘。
5.2.9為每個等分試樣準備單獨的一系列板。將1.0毫升每種選定的稀釋液分別放入兩個培養皿中。
5.2.10將約20毫升融化的大豆酪蛋白消化瓊脂倒入培養皿，冷卻至45º至50ºC。旋轉以確保充分混合并使瓊脂凝固。
5.2.11將嗜熱嗜熱地芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌30ºC–35ºC在55º–60ºC的平板上顛倒并孵育48至72小時。可將在55ºC至60ºC的溫度下孵育的設備放置在塑料袋中，以防止平板過度干燥。
5.2.12孵育后計數CFU。
5.2.13平均計數，然后乘以稀釋因子，以計算每個原始單位的人口。
5.2.14將所有信息記錄在生物學指標的人口確定記錄中。
5.2.15對于生物指示劑，密封的安瓿瓶，在無菌的250 ml錐形燒瓶中取4安瓿瓶，并通過搖晃燒瓶側面打破安瓿瓶。加入足量的無菌純凈水以制成100毫升＆渦旋或劇烈聲處理以獲得均勻的懸浮液。轉移10毫升至無菌螺旋蓋管中。執行上述步驟。

5.3孢子存活時間和殺死時間測試

對于嗜熱地熱芽孢桿菌
5.3.1為了存活時間，將一個生物指示劑放在一個合適的容器中，如培養皿的蓋子，并將其放置在事先合格的高壓滅菌器中。不要關閉培養皿，以使生物指示劑完全暴露在蒸汽中。根據生物指示劑分析證書，在121°C（±0.5ºC）的溫度下運行蒸汽滅菌循環，以縮短生存時間。立即從高壓滅菌器中卸下生物指示劑，并無菌轉移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在55°C至60°C下孵育7天。
5.3.2為了消滅時間，將一個生物指示劑放在合適的容器中，如培養皿的蓋子，然后將其放在事先合格的高壓滅菌器中。不要關閉培養皿，以使生物指示劑完全暴露在蒸汽中。根據生物指示劑分析證書，在121°C（±0.5ºC）的溫度下運行蒸汽滅菌循環，以達到zui小殺滅時間。立即從高壓滅菌器中卸下生物指示劑，并無菌轉移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在55°C至60°C下孵育7天。
5.3.3還要應用陽性和陰性對照。
5.3.4存活時間測試和陽性對照中應該有明顯的增長，而殺滅時間測試和陰性對照中沒有明顯的增長。
對于萎縮芽孢桿菌
5.3.5對于存活時間，將一個生物指示劑放在合適的容器中，如培養皿的蓋子，然后將其置于事先合格的DHS中。請勿關閉培養皿，以使生物指示劑完全暴露于干熱中。根據生物指標分析證書，在160°C（±1ºC）的溫度下運行DHS循環，以縮短生存時間。立即從DHS中卸下生物指示劑，并無菌轉移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在30°C至35°C下孵育7天。
5.3.6為了消滅時間，將一個生物指示劑放在適當的容器中，例如培養皿的蓋子，然后將其放置在事先合格的DHS中。請勿關閉培養皿，以使生物指示劑完全暴露于干熱中。根據生物指示劑分析證書，在160°C（±1ºC）的溫度下運行DHS循環，以達到zui小滅活時間。立即從DHS中卸下生物指示劑，并無菌轉移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在30°C至35°C下孵育7天。
5.3.7還要應用正面和負面的控制。
5.3.8存活時間測試和陽性對照中應該有明顯的增長，而殺滅時間測試和陰性對照中沒有明顯的增長。

5.4注意事項

5.4.1請勿使用已融化并保存超過8小時的瓊脂。
5.4.2為避免不準確的板數，使用2.0 ml移液器或孔徑較大的移液器進行連續轉移非常重要。這將有助于避免棉纖維堵塞移液器吸頭。

5.5極限/驗收標準

如果每個載體的活孢子的對數平均數不小于0.3 log，且不超過每個載體的對數標記的孢子數對總活菌數的0.48，則滿足測試要求。
相關：新的基因工程生物學指標

6.0縮寫

SOP：標準操作程序
QA：質量保證
QC：質量控制
NA：不適用
SCDA：大豆酪蛋白消化瓊脂
IPA：異丙醇
CFU：菌落形成單位